Biuretprovet

Biuretprovet^[1] är en metod för att påvisa peptidbindningar som finns i proteiner och peptider. Provet är baserat på reaktionen mellan kopparjoner och peptidbindningar i en alkalisk lösning. En violett färgreaktion tyder på närvaron av proteiner, eftersom de har stora mängder peptidbindningar. Reaktionen observerades första gången 1833.^[2] I Polen är biurettestet även känt som Piotrowskis test för att hedra den polske fysiologen Gustaw Piotrowski som självständigt återupptäckte det 1857.^[3] Flera varianter av testet har utvecklats, till exempel BCA-testet och det modifierade Lowry-testet.^[4]

Provet består i att en lösning av natriumhydroxid (NaOH) eller kaliumhydroxid (KOH), koppar(II)sulfat (CuSO₄) samt dubbelsaltet natriumkaliumtartrat (KNaC₄H₄O₆),^[5] varav det senare tillsätts för att kelatera och därmed stabilisera koppar(II)jonerna. Reaktionen av kopparjonerna med kväveatomerna involverade i peptidbindningar leder till förskjutning av peptidväteatomerna under de alkaliska förhållandena. En tri- eller tetradentat kelering med peptidkvävet producerar den karakteristiska färgen, som normalt är blå, men färgas violett när det reagerar med proteiner och rosa när det reagerar med mindre peptider.^[6] Provet har egentligen inget med biuret att göra annat än att biuret är den enklaste peptiden som kan påvisas med provet.

Den blå/lila färgen uppstår när aminogrupperna -NH- i proteinet tillsammans med koppar(II) bildar ett basiskt blått komplex [Cu(-NH-)₄]²⁺, som dock ibland kan vara genomskinligt.

Biuretprovet liknar Trommers prov på reducerande sockerarter, i det att bägge bygger på färgförändringar när kopparjoner är komplexbundna.

Två stora modifieringar av biurettestet används vanligtvis i modern kolorimetrisk analys av peptider: bicinchoninsyra (BCA)-analysen och Lowry-analysen. I dessa tester reagerar Cu⁺ som bildas under biuretreaktionen ytterligare med andra reagens, vilket leder till en djupare färg. I BCA-testet bildar Cu⁺ ett djupt lila komplex med bicinchoninsyra (BCA),^[7] som absorberar runt 562 nm, vilket ger den lila signaturfärg. Det vattenlösliga BCA/kopparkomplexet absorberar mycket starkare än peptid/kopparkomplexet, vilket ökar biurettestets känslighet med en faktor på cirka 100. BCA-analysen gör det möjligt att detektera proteiner i intervallet 0,0005 till 2 mg/ml. Dessutom ger BCA-proteinanalysen den viktiga fördelen av kompatibilitet med ämnen som upp till 5 procent är ytaktiva ämnen i proteinprover.

I Lowry-proteinanalysen oxideras Cu⁺ tillbaka till Cu²⁺ av Mo^VI i Folin-Ciocalteu-reagenset, som bildar molybdenblått (Mo IV ). Tyrosinrester i proteinet bildar också molybdenblått under dessa omständigheter.^[8] Molybdenblått kan i sin tur binda vissa organiska färgämnen som malakitgrönt och Auramine O, vilket resulterar i ytterligare förstärkning av signalen.^[9]

Den här artikeln är helt eller delvis baserad på material från engelskspråkiga Wikipedia, Biuret test, 12 augusti 2023.

• Whitford, David (2005). Proteins: Structure and function. Chichester: John Wiley & Sons. sid. 33. ISBN 978-0471-49894-0 

• Wikimedia Commons har media som rör Biuretprovet.